II. Этиология и индикаторы воспаления

1 Обнаружение нуклеиновой кислоты SARS-CoV-2

1.1 Сбор образцов

Для повышения чувствительности обнаружения важна «правильность» образцов, а также способов и сроков их сбора. Можно выделить следующие виды образцов: образцы из верхних дыхательных путей (мазки из зева, мазки из носа, носоглоточные секреты), образцы из нижних дыхательных путей (мокрота, секреты дыхательных путей, жидкость бронхоальвеолярного лаважа), кровь, кал, моча и конъюнктивальные секреты. Мокрота и другие образцы из нижних дыхательных путей имеют высокий коэффициент позитивности нуклеиновых кислот, их сбор является предпочтительным. SARS-CoV-2 разрастается преимущественно в альвеолярных клетках Il типа (AT2), а пик вирусовыделения наступает через 3—5 дней после начала болезни. Таким образом, если тест на нуклеиновую кислоту вначале отрицательный, следует продолжить сбор проб и протестировать их в последующие дни.

1.2 Обнаружение нуклеиновой кислоты

Анализ на нуклеиновые кислоты — предпочтительный метод диагностики инфекции SARS-CoV-2. Процедура тестирования согласно приведенным в наборе инструкциям выглядит следующим образом: Образцы подвергаются предварительной обработке, и вирус подвергается лизису для вычленения нуклеиновых кислот. Три специфических гена SARS-CoV-2, а именно: открытая рамка считывания 1a/b (ORF1a/b), гены нуклеокапсидного белка (N) и белка оболочки (E) — затем амплифицируются по методике количественной ПЦР в реальном времени. Амплифицированные гены обнаруживаются интенсивности флуоресценции. Назовем критерии положительных результатов анализа на нуклеиновые кислоты: Положительный тест на ген ORF1a/b и (или) ген N (ген E).

Одновременное обнаружение нуклеиновых кислот в нескольких видах образцов может повысить точность диагностирования. Примерно у 30—40 % пациентов с подтвержденным положительным анализом на нуклеиновую кислоту в дыхательных путях обнаружена вирусная нуклеиновая кислота в крови, а примерно у 50— 60 % пациентов с подтвержденным положительным анализом на нуклеиновую кислоту в дыхательных путях обнаружена вирусная нуклеиновая кислота в кале. Однако коэффициент позитивности тестирования на нуклеиновые кислоты в образцах мочи не очень высок. Комплексное тестирование образцов из дыхательных путей, кала, крови и других видов образцов помогает повысить диагностическую чувствительность в случае подозрения на болезнь, улучшить контроль за эффективностью лечения и руководство изоляционными мероприятиями после выписки.

2 Выделение и культивирование вируса

Культивирование вируса должно осуществляться в лаборатории с подтвержденным 3-м уровнем биологической безопасности (BSL-3). Вкратце процедуру можно описать следующим образом: У пациента берутся свежие образцы мокроты, кала и другие пробы, после чего они инокулируются в клетках Vero-E6 для культивирования вируса. Цитопатический эффект (ЦЭ) наблюдается через 96 часов. Обнаружение вирусной нуклеиновой кислоты в культуральной среде свидетельствует об успешном культивировании. Определение титра вируса: После последовательного растворения вирусного посевного материала в 10 раз TCID50 определяется микроцитопатическим методом. В противном случае жизнеспособность вируса определяется бляшкообразующей единицей (БОЕ).

3 Обнаружение сывороточного антитела

После заражения SARS-CoV-2 образуются специфические антитела. К методам определения сывороточных антител относятся иммунохроматография с использованием коллоидного золота, твёрдофазный иммуноферментный анализ, иммунохемилюминесценция и др. Положительный результат анализа на антигенспецифичный сывороточный титр класса IgM — или если титр специфических антител класса IgG в фазе выздоровления в ≥4 раза выше по сравнению с острой фазой — можно использовать в качестве диагностических критериев у пациентов с подозрением на COVID-19 и отрицательным результатом обнаружения нуклеиновых кислот. Во время диспансерного наблюдения IgM обнаруживается через 10 дней после появления симптомов, IgG — через 12. Вирусная нагрузка постепенно уменьшается по мере увеличения уровня сывороточных антител.

4 Выявление индикаторов воспалительной реакции

Рекомендуется сдавать анализы на C-реактивный белок, прокальцитонин, ферритин, D-димер, общее содержание и субпопуляции лимфоцитов, интерлейкинs IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, INF-у и другие индикаторы воспаления и иммунного статуса, которые могут помочь оценить клиническое течение болезни, оповещать о тяжелых и критических состояниях, а также служить основой для формирования стратегий лечения.

У большинства пациентов с COVID-19 нормальный уровень прокальцитонина и существенно повышенный уровень C-реактивного белка. Быстрое и существенное повышение уровня C-реактивного белка указывает на возможность вторичной инфекции. В тяжелых случаях уровень D-димера существенно возрастает, что потенциально служит фактором риска для неблагоприятного прогноза. У пациентов с общим низким количеством лимфоцитов в начале болезни обычно неблагоприятный прогноз. У пациентов в тяжелом состоянии неуклонно уменьшается количество лимфоцитов периферической крови. Уровень экспрессии IL-6 и IL-10 у пациентов в тяжелом состоянии значительно повышается. Контроль уровня IL-6 и IL-10 помогает оценить риск развития тяжелого состояния.

5 Обнаружение вторичных бактериальных или грибковых инфекций

Пациенты в тяжелом или критическом состоянии подвержены риску развития вторичных бактериальных или грибковых инфекций. Следует квалифицированно собирать образцы в очаге инфекции для бактериологического или грибкового посева. При подозрении на вторичную легочную инфекцию следует брать образцы мокроты, выделяемой из глубины лёгких, трахейных аспиратов, бронхоальвеолярного лаважа и щёточные образцы для культивирования. У пациентов с высокой температурой следует своевременно брать посев крови. У пациентов с подозрением на сепсис, которым был установлен постоянный катетер, следует брать посевы крови из периферических внутривенных катетеров. Рекомендуется брать у них анализ крови класса G и GM не реже двух раз в неделю, помимо посева на грибы.

6 Безопасность в лаборатории

Меры по обеспечению биологической безопасности должны определяться исходя из разных уровней риска, связанного с экспериментальным процессом. Индивидуальная защита должна соответствовать требованиям к защите в лабораториях BSL-3 применительно к взятию образцов из дыхательных путей, обнаружению нуклеиновой кислоты и работам по культивированию вируса. Индивидуальная защита в соответствии с требованиями к защите в лабораториях BSL-2 обязательна при взятии биохимических, иммунологических и других стандартных лабораторных анализов. Образцы должны транспортироваться в специальных контейнерах и боксах, отвечающих требованиям к биобезопасности. Все лабораторные отходы должны строго стерилизоваться в автоклаве.