II. Етіологія та індикатори запалення

1 Виявлення нуклеїнової кислоти SARS-CoV-2

1.1 Збір зразків

Для підвищення чутливості виявлення важливою є «правильність» зразків, а також способів і термінів їх збору. Можна виділити такі види зразків: зразки з верхніх дихальних шляхів (мазки із зіва, мазки з носа, носоглоткові секрети), зразки з нижніх дихальних шляхів (мокрота, секрети дихальних шляхів, рідина бронхоальвеолярного лаважа), кров, кал, сеча та кон'ю. Мокрота та інші зразки нижніх дихальних шляхів мають високий коефіцієнт позитивності нуклеїнових кислот, їх збір є кращим. SARS-CoV-2 розростається переважно в альвеолярних клітинах Il типу (AT2), а пік вірусовиділення настає через 3-5 днів після початку хвороби. Таким чином, якщо тест на нуклеїнову кислоту спочатку негативний, слід продовжити збирання проб і протестувати їх у наступні дні.

1.2 Виявлення нуклеїнової кислоти

Аналіз на нуклеїнові кислоти є кращим методом діагностики інфекції SARS-CoV-2. Процедура тестування згідно з наведеними в наборі інструкціями виглядає наступним чином: Зразки піддаються попередньої обробки, і вірус піддається лізису для вичленування нуклеїнових кислот. Три специфічні гени SARS-CoV-2, а саме: відкрита рамка зчитування 1a/b (ORF1a/b), гени нуклеокапсидного білка (N) та білка оболонки (E) – потім ампліфікуються за методикою кількісної ПЛР у реальному часі. Ампліфіковані гени виявляються інтенсивністю флуоресценції. Назвемо критерії позитивних результатів аналізу на нуклеїнові кислоти: Позитивний тест на ген ORF1a/b та (або) ген N (ген E).

Одночасне виявлення нуклеїнових кислот у кількох видах зразків може підвищити точність діагностування. Приблизно у 30-40% пацієнтів з підтвердженим позитивним аналізом на нуклеїнову кислоту в дихальних шляхах виявлена вірусна нуклеїнова кислота в крові, а приблизно у 50-60% пацієнтів з підтвердженим позитивним аналізом на нуклеїнову кислоту в дихальних шляхах. Проте коефіцієнт позитивності тестування на нуклеїнові кислоти у зразках сечі не дуже високий. Комплексне тестування зразків із дихальних шляхів, калу, крові та інших видів зразків допомагає підвищити діагностичну чутливість у разі підозри на хворобу, покращити контроль за ефективністю лікування та керівництво ізоляційними заходами після виписки.

2 Виділення та культивування вірусу

Культивування вірусу має здійснюватись у лабораторії з підтвердженим 3-м рівнем біологічної безпеки (BSL-3). Коротко процедуру можна описати так: У пацієнта беруться свіжі зразки мокротиння, калу та інші проби, після чого вони інокулюються у клітинах Vero-E6 для культивування вірусу. Цитопатичний ефект (ЦЕ) спостерігається через 96 годин. Виявлення вірусної нуклеїнової кислоти у культуральному середовищі свідчить про успішне культивування. Визначення титру вірусу Після послідовного розчинення вірусного посівного матеріалу в 10 разів TCID50 визначається мікроцитопатичним методом. Інакше життєздатність вірусу визначається бляшкоутворюючою одиницею (БОЕ).

3 Виявлення сироваткового антитіла

Після зараження SARS-CoV-2 утворюються специфічні антитіла. До методів визначення сироваткових антитіл відносяться імунохроматографія з використанням колоїдного золота, твердофазний імуноферментний аналіз, імунохемілюмінесценція та ін. Позитивний результат аналізу на антигенспецифічний сироватковий титр класу IgM — або якщо титр специфічних антитіл класу Ig - можна використовувати як діагностичні критерії у пацієнтів з підозрою на COVID-19 та негативним результатом виявлення нуклеїнових кислот. Під час диспансерного спостереження IgM виявляється через 10 днів після появи симптомів, IgG – через 12. Вірусне навантаження поступово зменшується зі збільшенням рівня сироваткових антитіл.

4 Виявлення індикаторів запальної реакції

Рекомендується здавати аналізи на C-реактивний білок, прокальцитонін, феритин, D-димер, загальний вміст та субпопуляції лімфоцитів, інтерлейкін IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, INF-у та інші індикатори запалення та імунного статусу , які можуть допомогти оцінити клінічний перебіг хвороби, сповіщати про тяжкі та критичні стани, а також служити основою для формування стратегій лікування.

У більшості пацієнтів з COVID-19 нормальний рівень прокальцитоніну та суттєво підвищений рівень C-реактивного білка. Швидке та суттєве підвищення рівня C-реактивного білка вказує на можливість вторинної інфекції. У важких випадках рівень D-димеру суттєво зростає, що потенційно є фактором ризику для несприятливого прогнозу. У пацієнтів із загальною низькою кількістю лімфоцитів на початку хвороби зазвичай несприятливий прогноз. У пацієнтів у тяжкому стані неухильно зменшується кількість лімфоцитів периферичної крові. Рівень експресії IL-6 та IL-10 у пацієнтів у тяжкому стані значно підвищується. Контроль рівня IL-6 та IL-10 допомагає оцінити ризик розвитку тяжкого стану.

5 Виявлення вторинних бактеріальних або грибкових інфекцій

Пацієнти у важкому або критичному стані схильні до ризику вторинних бактеріальних або грибкових інфекцій. Слід кваліфіковано збирати зразки у осередку інфекції для бактеріологічного чи грибкового посіву. При підозрі на вторинну легеневу інфекцію слід брати зразки мокротиння, що виділяється з глибини легень, трахейних аспіратів, бронхоальвеолярного лаважу та щіткові зразки для культивування. У пацієнтів із високою температурою слід своєчасно брати посів крові. У пацієнтів з підозрою на сепсис, яким було встановлено постійний катетер, слід брати посіви крові з внутрішньовенних периферичних катетерів. Рекомендується брати в них аналіз крові класу G та GM не рідше двох разів на тиждень, крім посіву на гриби.

6 Безпека в лабораторії

Заходи щодо забезпечення біологічної безпеки повинні визначатися, виходячи з різних рівнів ризику, пов'язаного з експериментальним процесом. Індивідуальний захист повинен відповідати вимогам до захисту в лабораторіях BSL-3 стосовно взяття зразків з дихальних шляхів, виявлення нуклеїнової кислоти та робіт з культивування вірусу. Індивідуальний захист відповідно до вимог до захисту в лабораторіях BSL-2 є обов'язковим при взятті біохімічних, імунологічних та інших стандартних лабораторних аналізів. Зразки повинні транспортуватися у спеціальних контейнерах та боксах, що відповідають вимогам до біобезпеки. Всі лабораторні відходи повинні суворо стерилізуватися в автоклаві.