Новый взгляд на пробиотик Bacillus subtilis: механизм действия и клиническое применение

Маной А. Сува, Вэран П. Сурейя, Дхармеш Б. Хени
кафедра фармакологии, К. Б. Институт фармацевтического образования и исследований, университет Кади Сарва Вишвавидъяляйя, г. Гандинагар, штат Гуджарат, Индия

Реферат: Пробиотики являются живыми микроорганизмами, которые оказывают благотворное влияние на здоровье хозяина. На протяжении длительного времени для обеспечения конкурентного вытеснения патогенов из кишечника применяются бактерии родов Lactobacillus и Bifidobacterium. Однако использование таких микроорганизмов связано с определенными ограничениями, которые обусловлены чувствительностью этих бактерий к кислой среде желудка и температуре, их медленным ростом и специфическими условиями, которые требуются для их стабильности. По этой причине возникла необходимость поиска новых пробиотиков, которые бы сохраняли свою стабильность в период хранения, а также при перемещении в ЖКТ, что обеспечило бы их повышенную эффективность. В отношении бактерий рода Bacillus имеются многочисленные подтвержденные данные, указывающие на возможность их применения в качестве предпочитаемых пробиотиков. В последнее время наблюдается значительный прогресс в изучении и научной оценке пробиотика Bacillus subtilis. Благодаря таким исследованиям был установлен механизм их антимикробного действия, обеспечиваемый синтезом антимикробных соединений, противодиарейный эффект, иммуностимулирующее действие, способность этого пробиотика к конкурентному вытеснению патогенов, снижению воспалительного процесса в кишечнике и нормализации кишечной микрофлоры. В ходе многочисленных доклинических и клинических исследований бактерий B. subtilis была установлена перспективность этих микроорганизмов для лечения и профилактики диареи различной этиологии. B. subtilis признаны безопасными FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США) и внесены в реестр квалифицированной презумпции безопасности Европейского агентства по безопасности продуктов питания (European Food Safety Authority), что дает основания считать этот пробиотик безопасным для лечения людей. Все перечисленные положительные свойства B. subtilis делают этот вид микроорганизмов наиболее привлекательной разновидностью пробиотиков для лечения различных клинических патологий.

Введение

Происхождение термина «пробиотики» связано со словосочетанием на греческом языке, имеющим значение «для жизни» [1]. ВОЗ/ФАО определяют пробиотики как «живые микроорганизмы, которые при поступлении в организм хозяина в адекватных количествах оказывают на него благотворное воздействие» [2]. Влияние различных факторов (воздействие внешней среды и/или метаболические изменения) может способствовать размножению патогенных микроорганизмов, что приводит к нарушению баланса между полезной и патогенной микрофлорой и развитию заболевания.

Синтетические антибиотики стали первым средством контроля роста и размножения патогенных микроорганизмов, однако чрезмерное применение таких лекарственных препаратов приводит к развитию множественной лекарственной устойчивости у патогенной микрофлоры. По этой причине лечение антибактериальными препаратами должно строго контролироваться. С этой точки зрения применение полезных бактерий (пробиотиков) стало альтернативой антибиотикам, благодаря их благотворному воздействию [3].

Бактерии Lactobacillus и Bifidobacterium применяются почти исключительно из-за их способности обеспечить конкурентное вытеснение патогенов из кишечника человека и животных. Однако существуют некоторые основные ограничения, связанные с производством пробиотических препаратов, содержащих бактерии Lactobacillus и Bifidobacterium:

• Такие микроорганизмы являются либо микроаэрофильными, либо полностью анаэробными – по этой причине их производство, транспортировка и хранения могут быть связаны со значительными сложностями;
• Для микроорганизмов Lactobacillus и Bifidobacterium характерен очень медленный рост;
• Они обладают повышенной чувствительностью к повышению температуры, из-за чего их необходимо хранить при пониженных температурах, а срок годности является достаточно коротким;
• Многие лактобактерии и бифидобактерии чувствительны к желудочному соку, что может сказаться на них отрицательным образом в ходе транзитного перемещения по ЖКТ [4].

Бактерии Bacillus clausii являются чрезвычайно многообразной группой микроорганизмов, которые известны на протяжении уже более 100 лет. К настоящему времени накоплены научные данные, которые позволяют с уверенностью утверждать об обоснованности применения этих бактерий в качестве пробиотиков [5]. В качестве пробиотиков для людей используются лишь несколько из более чем 100 представителей рода Bacillus clausii, а именно: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans,Bacillus coagulans var. toyoi, Bacillus natto (subtilis), Bacillus clausii, Bacillus clausii, и Bacillus coagulans [6]. Благодаря научным исследованиям, проведенным на протяжении последних десятилетий, удалось определить почти все свойства бактерий B. subtilis, что позволяет рассматривать микроорганизмы этого вида как наиболее привлекательный пробиотик с точки зрения клинического применения. В этом обзоре мы представляем данные экспериментальных и клинических исследований, что позволит получить полное представление о терапевтическом потенциале B. subtilis.

Бактерии Bacillus subtilis В природе

Микроорганизмы Bacillus clausii являются многочисленной группой палочковидных грамположительных бактерий, для которых характерно повышенное спорообразование [3]. Бактерии рода Bacillus clausii являются одними из наиболее распространенных в природе микроорганизмов. Микроорганизмы этого рода являются главным образом почвообитающими бактериями. Такие бактерии часто выделяют из воды, воздуха, и таких продуктов питания как пшеница, зерно других злаковых культур, цельнозерновая мука, соевые бобы, а также молочная микрофлора. Эти бактерии постоянно проникают в ЖКТ и дыхательные пути здоровых людей с пищей, водой и воздухом. В научной литературе имеются сообщения о выделении B. subtilis из желудочно-кишечного тракта здоровых взрослых и детей. Количество этих микроорганизмов в ЖКТ может достигать 10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 грамм, что сравнимо с числом лактобактерий. По этой причине некоторые исследователи утверждают, что микроорганизмы Bacillus clausii являются одним из доминирующих компонентов кишечной микрофлоры [5]. Успешно проведено полное секвенирование генома B. subtilis, что обеспечило резкое увеличение объема информации об этих микроорганизмах и развитие молекулярных и генных методологий [3].

Спорообразование у бактерий

Бактерии образуют споры для того чтобы успешно перенести крайне неблагоприятные условия. Споры обеспечивают бактериям длительное выживание в условиях, которые способны быстро убить вегетирующие микроорганизмы. Спорообразование в огромной степени зависит от наличия питательных веществ в непосредственной близости от живой клетки. Согласно сообщениям Cutting et al. (2009), уменьшение количества доступных питательных веществ ощущается бактерией и она начинает выполнять необратимую программу развития, которая в результате приводит к образованию спор (Рисунок 1) [7]. Бактериальная эндоспора содержит в своем ядре сжатую и инактивированную хромосому. Вокруг ядра располагается кора, богатая пептидгкликаном, и один или несколько слоев белкового материала, которые образуют оболочку споры. При дефиците питательных веществ обычная вегетирующая (бесспоровая) клетка (ВК) подвергается серии морфологических превращений, которые приводят к образованию предспоры (ПС) внутри спорангия (спорового мешочка) материнской клетки (МК) и некоторое время спустя спора (С) высвобождается в процессе лизиса МК [7].

Рисунок 1: Процесс споруляции у спорообразующих бактерий

Спорообразование у Bacillus subtilis и его преимущества

Споры B. subtilis обладают повышенной устойчивостью к действию температуры, повышенной кислотности желудочного сока, желчи и растворителей, что позволяет им выживать в условиях кишечника [3,5]. B. subtilis можно хранить на протяжении длительного периода времени вне холодильника [3].

Герминация спор Bacillus subtilis и их пролиферация в желудочно-кишечном тракте

Данные иммунологических исследований свидетельствуют о том, что споры Bacillus subtilis обладают способностью к герминации и пролиферации в кишечнике мышей, они также могут расти и вновь образовывать споры [8]. В ходе экспериментов с мышами авторы Casula и Cutting наблюдали герминацию спор B. subtilis как вегетативных клеток в тощей кишке и в подвздошной кишке животных с использованием механизма конкурентной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией направленной на измененный с помощью методов генной инженерии химерный ген ftsH-lacZ, который экспрессируется только вегетирующими клетками [9]. Ozawa с соавторами обнаружил, что споры B. subtilis штамма BN обладают способностью к герминации и размножению до определенной степени в ЖКТ свиней [10]. Leser et al. доказали, что B. subtilis способны герминировать и расти в проксимальной части ЖКТ свиней [11].

Механизм действия пробиотиков Bacillus subtilis

Предполагаемые механизмы действия B. subtilis включают в себя антимикробный эффект, возникающий благодаря синтезу антимикробных соединений, противодиарейный эффект, иммуностимулирующий эффект, конкурентное вытеснение патогенов, предотвращение развития воспаления в кишечнике и стимуляцию роста нормальной кишечной микрофлоры [11]. B. subtilis обладают уникальными свойствами как, например, способность к спорообразованию, разносторонность в усвоении питательных веществ, высокий уровень производства ферментов, быстрый рост и способность к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях [3].

Синтез антимикробных соединений

Бактерии Bacillus clausii играют значительную роль в кишечнике из-за из высокой метаболической активности. Активность этих бактерий определяется главным образом их способностью синтезировать антибиотики. С этой точки зрения бактерии вида B. subtilis обладают наивысшей продуктивностью, так как они способны вырабатывать 66 различных антибиотиков, и у них в синтезе таких соединений участвует до 4%-5% генома. Антибиотики, вырабатываемые бактериями Bacillus clausii, обладают различной структурой и спектром антимикробного действия [5]. О способности B. subtilis синтезировать антибиотики известно на протяжении уже 50 лет. Вещества с антимикробной активностью, которые синтезируются и секретируются микроорганизмами B. subtilis перечислены в Таблице 1 [12,14]. Синтезируемые B. subtilis антибиотики обладают широким спектром действия. Такие вещества являются естественной частью антимикробной защиты человека, что значительно уменьшает вероятность развития резистентности у патогенов или появления нежелательных побочных эффектов. По этой причине можно утверждать, что B. subtilis является идеальным терапевтическим выбором из-за широкого спектра действия и специфической и быстрой способности этих микроорганизмов уничтожать различные патогены [14]. Пробиотические свойства B. subtilis являются штамм-специфичными [3]. Из B. subtilis были выделены пектинолитические ферменты. Такие бактерии также вырабатывают аминокислоты и витамины [5].

Иммуностимулирующий эффект

B. subtilis усиливают защиту против патогенов с помощью стимулирования неспецифического и специфического иммунитета. Результаты исследований с участием животных и людей безошибочно свидетельствуют о том, что пероральный прием спор Bacillus clausii стимулирует иммунную систему. Споры B. subtilis вызывают гуморальный и клеточно-опосредованный иммунный ответ. Взаимодействие между спорами B. subtilis и макрофагами играет значительную роль в развитии как естественного, так и адаптивного иммунного ответа хозяина. В ходе многих исследований было доказано, что бактерии B. subtilis инициируют активацию макрофагов. Споры таких штаммов B. subtilis как B. subtilis B10, B. subtilis BS02 и B. subtilis (natto) B4 могут оказывать иммуномодулирующее воздействие благодаря индуцированию провоспалительных цитокинов и реализовывать антимикробную активность через активацию функций макрофагов. В дополнение к этому следует отметить, что B. subtilis не проявляли явной цитотоксичности в отношении клеток линии RAW 264.7 и поэтому эти бактерии можно считать безопасными [15, 16, 17]. Введение в организм спор B. subtilis MBTU PBBM1 приводит к усилению гуморального иммунного ответа (с помощью антител IgG and IgA) и к пролиферации Т-лимфоцитов. Это явление указывает на то, что споры B. subtilis MBTU PBBM1 обладают потенциалом к улучшению как гуморального так и клеточного иммунитета у мышей [18]. Условно-патогенные микроорганизмы играют большую роль в развитии лимфоидной ткани, ассоциированной с ЖКТ.

В ЖКТ бактерии B. subtilis вызывают активную пролиферацию лимфоцитов. Введение B. subtilis в аппендикс безмикробных кроликов способствует развитию лимфоидной ткани, ассоциированной с ЖКТ. Этот факт может служить подтверждением тому, что бактерии рода Bacillus clausii имеют большое значение и для развития такой системы, и для обеспечения мощного иммунного ответа [19]. Было обнаружено количественное и качественное сходство активации лимфоцитов с помощью B. subtilis с той, которая бывает вызвана митогеном фитогемагглютинином (ФГА) и конканавалином А. Была также обнаружена способность B. subtilis стимулировать выработку цитокина in vitro и после перорального введения мышам [5]. Пероральный прием спор B. subtilis здоровыми добровольцами приводил к дозозависимому увеличению экспрессии маркеров активации на лимфоцитах. Споры B. subtilis обладают способностью вызывать у мышей системный гуморальный иммунный ответ на фрагмент С анатоксина столбняка и на овальбумин. Эти данные можно рассматривать как подтверждение того факта, что споры B. subtilis могут стать эффективным средством усиления как системного гуморального иммунного ответа, так и ответа в слизистых оболочках [21].

Поддержание кишечного гомеостаза и предотвращение развития воспаления в кишечнике

Бактерии B. subtilis выделяют пентапетид, необходимый для дистанционных микроб-микробных взаимодействий (quorum-sensing) и компетенции, а также фактор споруляции. Эти микроорганизмы активируют ключевые сигнальные пути, включая МАП-киназу p38 и протеинкиназу В (Akt), в эпителиальных клетках кишечника хозяина. Колониестимулирующий фактор (CSF) также активирует белки теплового шока, которые защищают эпителиальные клетки кишечника от повреждений и утраты барьерной функции, что обеспечивает поддержание кишечного гомеостаза [22]. Молекулы CSF бактерий B. subtilis, обеспечивающие дистанционные микроб-микробные взаимодействия (quorum-sensing), уменьшают повреждение эпителия, вызванное кишечным воспалением, и повышают выживаемость мышей с летальной формой колита. Этот факт свидетельствует о том, что бактерии B. subtilis, являются потенциально полезными для лечения кишечного воспаления. Эти микроорганизмы полезны тем, что способны поддерживать кишечный гомеостаз и здоровье хозяина и могут применяться для терапии антибиотико-ассоциированных колитов, воспалительных заболеваний кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит) и некротизирующего энтероколита [23]. В ходе некоторых исследований было установлено, что отдельные виды бактерий Bacillus clausii (B. subtilis, Bacillus firmus, Bacillus megaterium, и B. pumilus) могут превращать генотоксичные вещества в инертные соединения [24]. Пероральное применение спор B. Subtilis, проявило терапевтическую эффективность для снижения инфекционной нагрузки и симптомов энтеропатии у детенышей мышей, инфицированных Citrobacter rodentium (животная модель диареи путешественников, вызываемой энтеротоксигенным патогеном (Escherichia coli). Заражение этим штаммом приводит к образованию изъязвлений на слизистой кишечника, криптовую гиперплазию и гибель [7,25]. Нарушение барьерной функции слизистой кишечника наблюдается при воспалительных заболеваниях кишечника (ВЗК). В биоптатах слизистой полученных от пациентов с ВЗК, наблюдаются отсутствие ключевых белков, обеспечивающих плотные контакты (ПК) между клетками эпителия – таких как трансмембранный белок клаудин-I, окклюдин, адгезивных молекул и белок зоны окклюденс. Воздействие B. subtilis на межклеточные контакты и на эндогенные регуляторные механизмы изучались на животной модели язвенного колита, вызванного декстран сульфатом натрия у мышей линии Balb/c. Применение B. subtilis значительно снижало показатели активности заболевания и нарастание повреждения тканей. Эти микроорганизмы также улучшали барьерную функцию путем снижения экспрессии эпителиальных белков, обеспечивающих плотные контакты (ПК) между клетками эпителия (трансмембранный белок клаудин-I, окклюдин, адгезивных молекул и белок зоны окклюденс), а также благодаря уменьшению повреждения эпителия, что обеспечивалось снижением экспрессии цитокинов (интерлейкин-6 [IL-6], IL-I7, IL-23 фактор некроза опухолей альфа) [26].

Поддержание нормальной микрофлоры кишечника

Наличие у бактерий B. subtilis способности поддерживать нормальный баланс кишечной микрофлоры была доказана в ходе многих исследований. Так, было обнаружен эффект микроорганизмов штамма B. subtilis 3 в отношении патогенных культур E. coli и Campylobacter в процессе лечения экспериментальных инфекций у мышей и способность бактерий этого штамма поддерживать нормальный баланс кишечной микрофлоры у подопытных животных в ходе антибиотикотерапии. В ходе экспериментов in vitro с бактериями B. subtilis, 3 у них был обнаружен широкий спектр антагонистической активности по отношению к использовавшимся патогенам – при этом не наблюдалось замедления роста нормальной микрофлоры [27]. Как показали опыты, использование штамма B. subtilis MA139 приводило к значительном увеличению числа микроорганизмов Lactobacillus и снижению популяции E. coli в кишечнике и экскрементах свиней [28]. А бактерии штамма KN-42 значительно увеличивали число лактобактерий и уменьшали число микроорганизмов патогенного штамма E. coli у поросят и, кроме того, улучшали их рост и развитие, а также их общее здоровье [29]. Было также установлено, что бактерии штамма B. subtilis KD1 улучшали состав кишечной микрофлоры бройлеров, увеличивали число лактобактерий и уменьшали число микроорганизмов E. coli и улучшали рост цыплят [30]. Введение бактерий B. subtilis var. natto мышам влияло на состав микрофлоры экскрементов, в особенности на численность видов Bacteroides и Lactobacillus. У мышей, получавших специальную диету, которая состояла из яичного белка, наблюдалось снижение числа бактерий Lactobacillus, но после регулярного добавления в корм спор B. subtilis var. Natto происходила стабилизация численности таких микроорганизмов. Применение казеиновой диеты приводило к увеличению численности бактерий Bacteroidaceae. Эти результаты указывают на то, что бактерии B. subtilis var. natto обладают способность поддерживать баланс естественной (кишечной) микрофлоры [24]. Таким образом, можно утверждать, что увеличение численности лактобактерий при одновременном уменьшении популяции E. coli может приводить к снижению заболеваемости диареей [29]. Сальмонелла является одним из основных пищевых патогенов; у людей она способна вызывать тяжелые заболевания как, например, брюшной тиф, бактериемия, очаговая (фокальная) инфекция и энтероколит. У бактерий штамма B. subtilis NC11 была обнаружена выраженная ингибирующая активность в отношении размножения патогена Salmonella enteritidis в эпителиальных клетках кишечника [31]. Эффект воздействия микроорганизмов B. subtilis CU1 на иммунную систему слизистой оболочки кишечника и баланс микрофлоры определялись на животной модели с участием мышей у которых был вызван антибиотикоассоциированный дисбиоз. Введение животным спор B. subtilis CU1 (3 х 10⁹ спор/день/особь) производилось до начала лечения антибактериальными препаратами и на протяжении всего курса антибиотикотерапии. Введение спор B. subtilis CU1 снижало воспаление кишечника, вызванное антибиотиками. Бактерии штамма B. subtilis CU1 вызывали нормализацию клеток B220+MHCII+B-cells в ткани мезентеральных лимфатических узлов и F4/80+ макрофаги в пейеровых бляшках у животных, получавших антибиотики. Введение спор B. subtilis CU1 уменьшало изменения в балансе кишечной микробиоты, которые были вызваны антибиотикотерапией. Эти данные свидетельствуют о том, что бактерии B. subtilis CU1 способствовали снижению воспаления, вызванного антибиотиками, путем нормализации иммунного ответа слизистой оболочки и кишечной микробиоты [32]. Принимая во внимание полезные свойства бактерий B. subtilis, эти микроорганизмы можно считать потенциальным кандидатом в пробиотики, применение которых возможно при различных клинических состояниях.

Клиические исследования свойств Bacillus subtilis

Терапия с помощью B. subtilis оказалась эффективной при лечении пациентов с различными инфекционными заболеваниями [33]. Клиническая эффективность этих микроорганизмов главным образом проявляется при их использовании в качестве противодиарейного средства, что уже используется во многих странах. Бактерии B. subtilis являются одним из наиболее важных видов микроорганизмов для лечения и профилактики кишечных заболеваний у людей [34]. Доказано, что при лечении диареи B. subtilis обеспечивают более выраженный эффект чем лактобактерии [5].

Регулирование частоты опорожнения кишечника

Labellarte et al. провели рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, в ходе которого 40 здоровых мужчин и женщин ежедневно на протяжении 20 дней принимали капсулы с B. subtilis в дозе приблизительно 1,9 х 10⁹ КОЕ на 1 капсулу. Результаты исследования свидетельствуют о том, что ежедневный прием B. subtilis обеспечивал регулярность опорожнения кишечника, причем такое лечение хорошо переносилось участниками [35].

Выживаемость в желудочно-кишечном тракте

Hanifi et al. провели рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, в ходе которого 81 здоровому взрослому участнику (возраст от 18 до 50 лет) был назначен прием B. subtilis R0179. участники принимали капсулы содержавшие бактерии B. subtilis R0179, в дозе 0,1, 1 либо 10 × 10⁹ КОЕ/капсула/день либо плацебо на протяжении 4-х недель. Определение количества жизнеспособных микроорганизмов в стуле участников показало, что степень выживаемости бактерий в ЖКТ была дозозависимой, а в конкретных цифрах результаты такого подсчета составили 0.1 × 10⁹ (4.6 ± 0.1 log10 CFU/g), 1 × 10⁹ (5.6 ± 0.1 log10 CFU/g) and 10 × 10⁹ (6.4 ± 0.1 log10 CFU/g) соответственно (P < 0.0001).

B. subtilis R0179 сохраняют жизнеспособность во время транзита через ЖКТ человека и хорошо переносятся взрослыми здоровым людьми в дозах от 0,1 до 10 х 10⁹ КОЕ/день [36].

Диарея и антибиотикоассоциированная диарея

Имеются сообщения об эффективности применения бактерий Bacillus clausii при лечении инфекций ЖКТ. Mazza (1994) подытожил результаты многочисленных исследований и пришел к выводу, что B. subtilis являются одним из важнейших видов микроорганизмов, которые можно применять для лечения и профилактики кишечных заболеваний у людей [34]. В ходе клинических исследований с участием пациентов с острыми формами кишечных инфекций участники получали B. subtilis и B. licheniformis (2 × 10⁹ микробных клеток; Biosporin). Результаты указывают на выраженный лечебный эффект пробиотиков, содержащих микроорганизмы Bacillus clausii, что проявлялось быстрой нормализацией стула, уменьшением болей в области живота и уменьшением кишечного дисбиоза. Применение микроорганизмов Bacillus clausii было безопасным, и такое лечение хорошо переносилось испытуемыми [37]. Проводилась также оценка влияния B. subtilis и B. licheniformis (Biosporin) на состав кишечной микрофлоры при лечении острых расстройств пищеварения и дисбактериозов у 53 новорожденных с перинатальной патологией. Результаты указывают на существование легкого лечебного и профилактического эффекта без побочных эффектов при лечении дисбактериозов и диареи у новорожденных [38]. Одним из наиболее частых побочных эффектов антибиотикотерапии является антибиотикоассоциированная диарея (ААД). Частота заболеваемости ААД зависит от типа применяемого антибиотика и варьирует в пределах от 25% до 44%. Способ ввода антибактериального средства (пероральный или парентеральный) не влияет на риск развития ААД и это заболевание может развиться у пациентов, принимающих антибиотики, вне зависимости от их возраста или пола. Тяжесть ААД может варьировать от неосложненной формы до псевдомембранозного колита, связанного с Clostridium difficile. Ведущим механизмом развития ААД являются значительные изменения в составе и качестве кишечной микрофлоры в процессе лечения антибиотиками. ААД может быть вызвана различными кишечными патогенами как, например, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Candida albicans, Clostridium perfringens, и Klebsiella spp.

Рисунок 2: Увеличение уровня секреторного IgA в слюне

Бактерии Bacillus clausii вызывают повышенный интерес исследователей как эффективные пробиотики, которые можно использовать для лечения и профилактики кишечных инфекций. В ходе одного исследования была обнаружена высокая эффективность лечения острых кишечных заболеваний с помощью пробиотиков Bacillus clausii: B. subtilis 3 и B. licheniformis 31 (с преобладанием бактерий B. subtilis 3 в 50:1 частей; Biosporin) [39]. В ходе клинического исследования прием спор B. subtilis (4 х 10⁹) был назначен 11 детям в возрасте от 3-х до 24-х месяцев на протяжении 5 дней в качестве дополнения к антибиотикотерапии. Монотерапию антибиотиком получали 8 испытуемых. Результаты этого исследования указывают на увеличение частоты стула у участников, получавших только антибиотик, в то время как в группе комбинированной терапии таких изменения отсутствовали. Монотерапия антибиотиком также приводила к увеличению численности сахаролитических бактерий и аэробной и анаэробной микрофлоры [40]. Horosheva с соавторами провела рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование с участием амбулаторных больных в возрасте ≥45 лет, которым было назначено лечение с помощью ≥1 перорального или внутривенного антибиотика на протяжении не менее 5 дней. В одной из групп (n = 90) пациенты получали пробиотик B. subtilis 3 (2 × 10⁹ КОЕ/ампулу) 2 раза в день. Прием пробиотика был начат за 1 день до начала антибиотикотерапии и завершился 7 дней спустя после отмены антибактериального препарата. Авторы этого исследования установили, что ААД развилась у 25,6% (23/90) больных в группе плацебо, в то время как в группе B. subtilis 3 заболеваемость этой формой диареи была существенно ниже – ААД развилась у 7,8% (7/90) пациентов (Р < 0,001). Применение B. subtilis 3 также было связано со снижением частоты развития таких побочных эффектов антибиотикотерапии как тошнота, рвота, вздутие живота и абдоминальные боли [39]. Было проведено в общей сложности 23 клинических исследования с участием боли 1 800 пациентов, которым был назначен прием комбинации пробиотика of B. subtilis R0179 с другим пробиотиком. Такая схема лечения использовалась для улучшения симптомов хронической диареи и синдрома раздраженного кишечника, а также в качестве вспомогательной терапии на фоне приема больными сульфасалазина и месалазин для увеличения периода ремиссии язвенного колита низкой и умеренной степени тяжести и для улучшения комплаентности при проведении трехкомпонентной эрадикационной терапии инфекции Helicobacter pylori [41]. возраста. В ходе этого исследования участникам назначался прием B. subtilis CU1 (2 × 10⁹ спор ежедневно) либо плацебо в течение периода продолжительностью 10 дней, после чего следовал перерыв продолжительностью 18 дней – эта схема повторялась 4 раза на протяжении всего периода исследования (4 месяца). Анализ биологических образцов, полученных от 44 испытуемых, показал, что прием B. subtilis CU1 приводил к значительному увеличению уровня секреторного IgA в слюне и стуле участников по сравнению с плацебо (Рисунки 2 и 3) [42]. Секреторный иммуноглобулин А (sIgA) является ключевым компонентом для поддержания гомеостаза кишечной микробиоты и для защиты ЖКТ и дыхательных путей против патогенов. Как было установлено в ходе опытов с мышами B. subtilis CU1 способны увеличивать численность В-клеток, вырабатывающих IgA, в пейеровых бляшках (Racedo SM and Urdaci MC, неопубликованные наблюдения). Можно утверждать, что B. subtilis CU1 усиливают генерацию клеток β7+IgA+B в пейеровых бляшках тонкой кишки. Процесс хоуминга В-клеток, вырабатывающих IgA, в слизистую кишечника и слюнные железы приводит к повышению уровня IgA в слюне и стуле. Бактерии B. subtilis CU1 значительно повышают уровень сывороточного интерферона γ (ИФН-γ) и стимулируют системный иммунный ответ. ИФН-γ играет большую роль в защите хозяина против различных инфекционных заболеваний. Включая вирусные инфекции, и выполняет ряд иммунных функций как, например, стимуляция макрофагов и естественных клеток-киллеров. Ретроспективный анализ данных по 44 участникам показал снижение частоты респираторных инфекций в подгруппе, получавшей B. subtilis CU1 по сравнению с группой плацебо. Эти результаты дают основания утверждать, что назначение B. subtilis CU1 может быть эффективным и безопасным методом стимуляции иммунных ответов [42].

Рисунок 3: Увеличение уровня секреторного IgA в стуле

Безопасность Bacillus subtilis

В соответствии с данными Европейского научного комитета по питанию животных (European Scientific Committee on Animal Nutrition) была проведена специальная проверка бактерий B. subtilis, в ходе которой не удалось обнаружить токсичности у этих микроорганизмов. Исследования на животных, посвященные острой и хронической токсичности, также свидетельствуют о безопасности этих штаммов. B. subtilis признаны безопасными FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США), что свидетельствует об отсутствии у них вредного воздействия на человеческий организм [3]. Эти микроорганизмы внесены в реестр квалифицированной презумпция безопасности Европейского агентства по безопасности продуктов питания (European Food Safety Authority), что дает основания считать эти пробиотики безопасным для лечении людей [43]. Бактерии B. subtilis можно считать совершенным многофункциональным пробиотиком для лечения пациентов [3].

Выводы

В течение последних двух десятилетий мировой рынок пробиотических добавок значительно увеличился, благодаря их важным клиническим преимуществам. Бактерии Lactobacillus и Bifidobacterium являются наиболее распространенными пробиотиками, что обусловлено в первую очередь их способностью вытеснять патогенные микроорганизмы. Однако эти бактерии не обладают такой многофункциональностью как B. subtilis. Бактерии рода Bacillus clausii привлекают повышенное внимание исследователей в качестве перспективных пробиотиков, благодаря их выраженным противомикробным свойствам, противодиарейному и иммуностимулирующему эффекту, способности стимулировать рост естественной микрофлоры и предупреждать развития воспаления кишечника. Кроме этого, такие микроорганизмы обладают отличным профилем стабильности в неблагоприятных условиях. Их эффективность и безопасность были доказаны в ходе многочисленных рандомизированных двойных слепых клинических исследований и подтверждены и одобрены такими авторитетными организациями как FDA и EFSA. С этой точки зрения B. subtilis обладают необходимым потенциалом для того, чтобы стать «совершенным многофункциональным пробиотическими бактериями» для терапии различных клинических состояний у людей.

Источники

1. Reid G, Jass J, Sebulsky MT, McCormick JK. Potential uses of probiotics in clinical practice. Clin Microbiol Rev 2003;16:658-72.
2. FAO/WHO. Probiotic in Foods: Health and Nutritional Properties and Guidelines for Evaluation. In FAO Food and Nutrition. Rome, Italy: FAO/ WHO; 2005. p. 85.
3. Olmos J, Paniagua-Michel J. Bacillus subtilis a potential probiotic bacterium to formulate functional feeds for aquaculture. J Microb Biochem Technol 2014;6:7.
4. Vasquez AP. Bacillus species are superior probiotic feed-additives for poultry. J Bacteriol Mycol Open Access 2016;2:00023.
5. Sorokulova I. Modern status and perspectives of Bacillus bacteria as probiotics. J Prob Health 2013;1:4.
6. Urdaci MC, Bressollier P, Pinchuk I. Bacillus clausii probiotic strains: Antimicrobial and immunomodulatory activities. J Clin Gastroenterol 2004;38 6 Suppl: S86-90.
7. Cutting SM, Van PH, Dong TC. Bacillus probiotics. Nutra foods 2009;8:7-14.
8. Tam NK, Uyen NQ, Hong HA, Duc le H, Hoa TT, Serra CR, et al. The intestinal life cycle of Bacillus subtilis and close relatives. J Bacteriol 2006;188:2692-700.
9. Casula G, Cutting SM. Bacillus probiotics: Spore germination in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 2002;68:2344-52.
10. Ozawa K, Yokota H, Kimura M, Mitsuoka T. Effects of administration of Bacillus subtilis strain BN on intestinal flora of weanling piglets. Nihon Juigaku Zasshi 1981;43:771-5.
11. Leser TD, Knarreborg A, Worm J. Germination and outgrowth of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis spores in the gastrointestinal tract of pigs. J Appl Microbiol 2008;104:1025-33.
12. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: Structures, syntheses and specific functions. Mol Microbiol 2005;56:845-57.
13. Baruzzi F, Quintieri L, Morea M, Caputo L. Antimicrobial compounds produced by Bacillus spp. and applications in food. In: Vilas AM, editor. Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. Badajoz, Spain: Formatex; 2011. p. 1102-11.
14. Sumi CD, Yang BW, Yeo IC, Hahm YT. Antimicrobial peptides of the genus Bacillus: A new era for antibiotics. Can J Microbiol 2015;61:93-103.
15. Huang Q, Xu X, Mao YL, Huang Y, Rajput IR, Li WF. Effects of Bacillus subtilis B10 spores on viability and biological functions of murine macrophages. Anim Sci J 2013;84:247-52.
16. Huang Q, Li YL, Xu X, Huang Y, Cui ZW, Yu DY, et al. Modulatory effects of Bacillus subtilis BS02 on viability and immune responses of RAW 264.7 murine macrophages. J Anim Vet Adv 2012;11:1934-8.
17. Xu X, Huang Q, Mao Y, Cui Z, Li Y, Huang Y, et al. Immunomodulatory effects of Bacillus subtilis (natto) B4 spores on murine macrophages. Microbiol Immunol 2012;56:817-24.
18. Sebastian AP, Keerthi TR. Immunomodulatory effect of probiotic strain Bacillus subtilis MBTU PBBMI spores in Balb/C Mice. Int J Eng Tech Res 2014;2:258-60.
19. Huang JM, La Ragione RM, Nunez A, Cutting SM. Immunostimulatory activity of Bacillus spores. FEMS Immunol Med Microbiol 2008;53:195-203.
20. Caruso A, Flamminio G, Folghera S, Peroni L, Foresti I, Balsari A, et al. Expression of activation markers on peripheral-blood lymphocytes following oral administration of Bacillus subtilis spores. Int J Immunopharmacol 1993;15:87-92.
21. Barnes AG, Cerovic V, Hobson PS, Klavinskis LS. Bacillus subtilis spores: A novel microparticle adjuvant which can instruct a balanced Th1 and Th2 immune response to specific antigen. Eur J Immunol 2007;37:1538-47.
22. Fujiya M, Musch MW, Nakagawa Y, Hu S, Alverdy J, Kohgo Y, et al. The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter. Cell Host Microbe 2007;1:299-308.
23. Okamoto K, Fujiya M, Nata T, Ueno N, Inaba Y, Ishikawa C, et al. Competence and sporulation factor derived from Bacillus subtilis improves epithelial cell injury in intestinal inflammation via immunomodulation and cytoprotection. Int J Colorectal Dis 2012;27:1039-46.
24. Hong HA, Duc Le H, Cutting SM. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiol Rev 2005;29:813-35.
25. D’Arienzo R, Maurano F, Mazzarella G, Luongo D, Stefanile R, Ricca E, et al. Bacillus subtilis spores reduce susceptibility to Citrobacter rodentium-mediated enteropathy in a mouse model. Res Microbiol 2006;157:891-7.
26. Gong Y, Li H, Li Y. Effects of Bacillus subtilis on epithelial tight junctions of mice with inflammatory bowel disease. J Interferon Cytokine Res 2016;36:75-85.
27. Sorokulova I. Preclinical testing in the development of probiotics: A regulatory perspective with Bacillus strains as an example. Clin Infect Dis 2008;46 Suppl 2:S92-5.
28. Guo X, Li D, Lu W, Piao X, Chen X. Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs. Antonie Van Leeuwenhoek 2006;90:139-46.
29. Hu Y, Dun Y, Li S, Zhao S, Peng N, Liang Y. Effects of Bacillus subtilis KN-42 on growth performance, diarrhea and faecal bacterial flora of weaned piglets. Asian Australas J Anim Sci 2014;27:1131-40.
30. Wu BQ, Zhang T, Guo LQ, Lin JF. Effects of Bacillus subtilis KD1 on broiler intestinal flora. Poult Sci 2011;90:2493-9.
31. Thirabunyanon M, Thongwittaya N. Protection activity of a novel probiotic strain of Bacillus subtilis against Salmonella enteritidis infection. Res Vet Sci 2012;93:74-81.
32. Racedo S, Jacquot C, Pinchuk I, Urdaci M. F. 84. Probiotic Bacillus subtilis CU1 Normalize the Mucosal Immune Responses and Microbiota Balance in a Murine Model of Dysbiosis. 15th International Congress of Mucosal Immunology (ICMI 2011) Abstract Supplement; 5-9 July, 2011. p. 151.
33. Pham Ngoc T, Vu Thi C, Nguyen Thi H. Bacillus subtilis in therapy and prevention of disease. Rev Immunol Ther Antimicrob 1968;32:53-65.
34. Mazza P. The use of Bacillus subtilis as an antidiarrhoeal microorganism. Boll Chim Farm 1994;133:3-18.
35. Labellarte G, Cooper S, Maher M. Tolerance and efficacy of a probiotic supplement delivered in capsule form. FASEB J 2015;29 Suppl 924:33.
36. Hanifi A, Culpepper T, Mai V, Anand A, Ford AL, Ukhanova M, et al. Evaluation of Bacillus subtilis R0179 on gastrointestinal viability and general wellness: A randomised, double-blind, placebo-controlled trial in healthy adults. Benef Microbes 2015;6:19-27.