Бактерии рода Bacillus: современный статус и перспективы использования в качестве пробиотиков

Ирина Сорокулова
кафедра анатомии, физиологии и фармакологии, Обернский университет, г. Оберн, США

Введение

Под термином «пробиотики» обычно подразумеваются «живые микроорганизмы, которые при введении в организм в адекватных количествах оказывают благотворное воздействие на организм хозяина» [1]. Хотя в настоящее время к категории пробиотиков принято относить различные микроорганизмы, обычно этим термином обозначаются представители двух главных родов – Lactobacillus и Bifidobacterium. Интерес исследователей к другим пробиотическим бактериям несколько меньше. Среди последних можно выделить бактерии рода Bacillus – группу с большим разнообразием видов, известную ученым на протяжении уже более 100 лет. К настоящему времени накоплены научные данные, которые позволяют с уверенностью утверждать об обоснованности применения этих бактерий в качестве пробиотиков.

Бактерии Bacillus в природе

Бактерии рода Bacillus являются одними из наиболее распространенных в природе микроорганизмов. Виды Bacillus являются главным образом почвообитающими бактериями [2, 3]. Бактерии, относящиеся к этому роду, также часто выделяют из воды [4] и воздуха [5]. Поскольку такие микроорганизмы повсеместно встречаются в почве, воздухе и воде, они легко проникают в продукты питания. Количество бактерий Bacillus в зерне пшеницы и цельнозерновой муке может достигать 106 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 грамм [6, 7]. Вследствие того, что споры этих бактерий обладают повышенной устойчивостью к действию высокой температуры, они способны выживать в процессе хлебопечения и потому могут встречаться в хлебе и других продуктах, полученных с помощью процесса выпечки [8]. Бактерии Bacillus часто являются компонентом микрофлоры молока, они не гибнут при пастеризации и могут стать доминирующими микроорганизмами в молочных продуктах, подвергшихся процессу пастеризации [9]. Микроорганизмы Bacillus являются доминирующей микрофлорой соевых бобов и принимают участие в процессе ферментации продуктов и приправ из сои [10, 11]. В подобных случаях доминирующими являются микроорганизмы видов Bacillus subtilis и B. licheniformis – в ферментированных продуктах их количество может достигать 108 КОЕ/г [12]. В Японии вар B. subtilis, носящий название Natto, используется для производства одноименного популярного продукта питания («натто»), разновидности соевого сыра, получаемого путем ферментации пропаренных соевых бобов [13].

Таким образом, можно утверждать, что бактерии рода Bacillus постоянно проникают в пищеварительный тракт и дыхательную систему здоровых людей с пищей, водой и воздухом. Имеются сообщения о выделении бактерий Bacillus из кишечной микрофлоры здоровых взрослых [14] и детей [15]. Количество таких микроорганизмов в кишечнике может достигать 107 КОЕ/г [16], что сравнимо с численностью бактерий рода Lactobacillus. По этой причине некоторые исследователи утверждают, что микроорганизмы Bacillus являются одним из доминирующих компонентов кишечной микрофлоры[17]. Такие бактерии обладают устойчивостью к действию кислоты и желчи и сохраняют жизнеспособность в кишечнике [18, 19]. В условиях абсолютной анаэробности эти микроорганизмы используют соединения азота в качестве акцепторов электронов и приобретают способность к росту и делению в анаэробной среде [20, 21].

Пробиотическая активность бактерий Bacillus

Микроорганизмы рода Bacillus способны играть важную роль в функции кишечника, поскольку они обладают высокой метаболической активностью. Активность Bacillus определяется главным образом их способностью вырабатывать антибиотики. К настоящему времени идентифицированы 795 соединений с антибактериальной активностью, которые вырабатываются бактериями Bacillus [22]. С этой точки зрения наиболее продуктивными являются бактерии вида B. subtilis, способные вырабатывать 66 различных антибиотиков, у которых в синтезе таких соединений участвует до 4%-5% генома [23]. Антибиотики, синтезируемые микроорганизмами Bacillus, различаются по структуре и спектру активности. Большинство соединений с антибактериальной активностью являются пептидами, но, вместе с тем, некоторые штаммы производят антибиотики, относящиеся к другим классам химических соединений. Это, например, аминогликозидный антибиотик бутирозин, синтезируемый B. circulans; протицин, содержащий фосфор, который синтезируют бактерии B. licheniformis [13]; производное изокумарина бацифелацин, вырабатываемый B. thiaminolyticus [24]; амикумацин А, синтезируемый B. subtilis [25]. Антибиотики, вырабатываемые бактериями Bacillus, различаются между собой по спектру противомикробной активности. Некоторые штаммы Bacillus синтезируют бактериоцины, которые обладают активностью по отношению только к бактериям того же вида, другие вырабатывают антибиотики с активностью против грамотрицательных или грамположительных бактерий, а другие штаммы Bacillus способны синтезировать вещества с широким спектром антибактериального действия (включая активность против грибов и простейших). Подобные антибиотики могут синтезироваться как в аэробных условиях, так и в анаэробных.

В определенной степени антимикробная активность бактерий Bacillus может быть обусловлена их способностью синтезировать литические ферменты. Так, литические ферменты, продуцируемые B. subtilis YU-1432, обладают эффективностью против микроорганизмов вида Porphyromonas gingivalis, являющихся причиной пародонтита [26]. Фибринолитические ферменты, синтезируемые B. vallismortis, обладают выраженной способностью вызывать лизис бактерий Streptococcus mutants [27]. Литические ферменты, производимые некоторыми микроорганизмами Bacillus, обладают активностью против грамотрицательных бактерий [28], у других имеется высокая активность против широкого спектра грамотрицательных и грамположительных бактерий [29, 30] и дрожжевых грибов [31].

Бактерии Bacillus способны поддерживать пищеварительную функцию кишечника, производя важные ферменты. Высокая амилолитическая способность обнаружена у таких бактерий, которые синтезируют кислотоустойчивые ферменты [32]. Из бактерий Bacillus также часто выделяют пектилитические ферменты – способностью вырабатывать такие ферменты в большей мере обладают микроорганизмы B. subtilis [33]. Некоторые штаммы Bacillus обладают липолитической и целлюлолитической активностью [34, 35]. Бактерии Bacillus также характеризуются как обладающие высокой протеолитической активностью [36]. Протеолитические ферменты Bacillus стимулируют процессы регенерации [37] и повышают фибринолитическую активность в плазме даже после перорального приема [38]. Кроме того, протеолитические ферменты Bacillus принимают участие в нормализации пищеварения, так как они обеспечивают разложение аллергенов [40] и факторов, препятствующих нормальному перевариванию пищи [39]. Ферменты, синтезируемые Bacillus, могут стимулировать нормальную кишечную микрофлору. Так, например, субтилизин и каталаза, вырабатываемые B. subtilis в процессе производства натто способствуют росту и повышению жизнеспособности лактобактерий [41]. Ферменты, вырабатываемые Bacillus, проявляют активность в живых и мертвых клетках [42].

Бактерии Bacillus синтезируют аминокислоты, включая незаменимые [43, 44], и витамины [45, 46]. В ходе экспериментов in vitro у некоторых штаммов Bacillus была выявлена способность разлагать холестерин [47], кроме того на животной модели была доказана способность этих бактерий после перорального приема значительно снижать уровень липопротеинов низкой плотности в плазме, а также уровень общего холестерина и триглицеридов [48].

Микроорганизмы Bacillus способны оказывать значительное влияние на иммунологический статус хозяина. Пероральный прием B. subtilis вызывает дозозависимое увеличение экспрессии маркеров активности на лимфоцитах [49]. Обнаружено количественное и качественное сходство активации лимфоцитов с помощью B. subtilis с той, которая бывает вызвана митогеном фитогемагглютинином (ФГА) и конканавалином А (ConA) [50]. Была также обнаружена способность B. subtilis стимулировать выработку цитокина in vitro и после перорального введения мышам [51, 52]. Адъювантные свойства бактерий Bacillus были подтверждены в ходе многих исследований. Микроорганизмы B. subtilis обладают способностью вызывать у мышей системный гуморальный иммунный ответ на фрагмент анатоксина столбняка овальбумин Cand [53]. Погибшие споры B. subtilis способны повышать уровни системного IgG и фактора иммунитета слизистых sIgA, специфичного к гриппу после интраназального введения мышам [54].

Пентапептид, принимающий участие в образовании бактериального ощущения кворума (quorum-sensing) у бактерий B. subtilis, их компетенция и фактор спорообразования активируют главные сигнальные пути выживания в эпителиальных клетках кишечника хозяина [55]. В ходе некоторых исследований было доказано, что фактор спорообразования способен активировать белки теплового шока, которые защищают эпителиальные клетки кишечника от повреждения и утраты барьерной функции. Таким образом, бактерии Bacillus обеспечивают хозяину способность поддержания кишечного гомеостаза.

Опубликованные данные также указывают на существование возможности выделить такие пробиотические штаммы бактерий Bacillus, которые обладают высокой эффективностью. Вместе с тем, пробиотическая активность является штамм-специфичной. Например, результаты исследования различных пробиотических штаммов Bacillus на антимикробную активность против клинических штаммов патогенов с множественной (лекарственной) устойчивостью свидетельствуют о том, что только один штамм B. subtilis3 обладал нужной эффективностью как в экспериментах in vitro, так и на животной модели [56, 57]. Таким образом, можно сделать вывод о том, что каждый отдельный штамм необходимо проверять на наличие пробиотической активности в индивидуальном порядке.

Безопасность бактерий Bacillus

На протяжении всего существования человечества как биологического вида люди находились в постоянном контакте с этими бактериями. Доказательством этому может служить обнаружение бактерий Bacillus в вечной мерзлоте, возраст которой составлял 105 лет [58]; выделение таких микроорганизмов из янтаря, обнаруженного в Доминиканской Республике, возраст которого составлял 25-40 миллионов лет [59, 60], а также обнаружение спор бактерий в солевых кристаллах возрастом 250 миллионов лет [61]. Некоторые ученые вообще считают споры Bacillus наиболее древними из известных клеточных структур [62, 63].

У микроорганизмов Bacillus имеется долгая история их безопасного использования в пищевых продуктах. На протяжении многих веков такие бактерии применялись для приготовления продуктов питания методом щелочной ферментации, при котором они были доминирующей микрофлорой [64]. Люди постоянно подвергались воздействию бактерий рода Bacillus из окружающей среды без каких-либо доказательств того, что такие микроорганизмы могут вызывать вспышки заболеваний (за исключением B. anthracis и B. cereus) или оказывать какое-либо вредное воздействие на человеческий организм. В научной литературе имеются описания случаев инфекций, вызванных «непатогенными» видами Bacillus [65].

Однако частота таких случаев низкая и она сравнима с частотой тех заболеваний, которые вызываются микроорганизмами других видов, относящихся к нормальной микробиоте – как, например, бактериями Lactobacillus [66] и Bifido [67]. Хорошо известно, что патогенность бактерий связана со штаммами; таким образом, каждый штамм микроорганизмов следует проверять в индивидуальном порядке на предмет пригодности его для использования в качестве пробиотика.

Патогенный потенциал некоторых штаммов Bacillus уже известен, так что некоторое время назад сотрудники Научного комитета ЕС по вопросам питания животных (European Scientific Committee on Animal Nutrition) предложили схему по тестированию синтеза токсинов бактериями Bacillus, используемыми в качестве диетарной добавки [68]. В соответствии с этой схемой были проверены некоторые штаммы B. subtilis, B. licheniformis [69], B. subtilis и B. indicus [70], и результаты исследований свидетельствуют об отсутствии токсичности. Дополнительные эксперименты на животных (в частности, проверки на острую и хроническую токсичность) также показали безопасность этих штаммов. Так, B. subtilis RO179 показал безопасность в ходе экспериментов in vitro и при проверке хронической оральной токсичности на крысах [71]. Безопасность B. coagulans была продемонстрирована в ходе проверки острой и субхронической оральной токсичности [72] и проверки оральной токсичности в ходе экспериментов, продолжавшихся 1 год [73]. Результаты этих исследований указывают на то, что введение животным бактерий Bacillus даже в высоких дозах не приводило к токсическому эффекту либо другим нежелательным последствиям связанных с проверяемыми культурами микроорганизмов. Данные о токсичности штаммов Bacillus [69] соответствовали данным о профиле безопасности Lactobacillus и Bifidobacteria [74, 75].

Современный статус пробиотиков, содержащих бактерии Bacillus

Первые клинические данные об успешном лечения инфекций желудочно-кишечного тракта с помощью бактерий Bacillus были опубликованы во Франции [76]. Приблизительно в то же время появились и сообщения об эффективности профилактического лечения дисбиоза с помощью Bacillus sp. IP 5832 на фоне антибиотикотерапии [77]. Терапия с помощью B. subtilis также оказалась высокоэффективной при лечении различных заболеваний инфекционной природы [78]. Mazza [79] подытожил основные результаты исследований, посвященных клинической эффективности B. subtilis при лечении диареи, которые были проведены в различных странах. Этот автор пришел к выводу, что B. subtilis является одним из наиболее важных микроорганизмов для терапии и профилактики кишечных заболеваний у людей. Бактерии B. subtilis проявили более высокую терапевтическую эффективность при лечении острой диареи, чем лактобактерии [80].

Была также доказана клиническая эффективность B. coagulans при лечении диареи, дисбиозов, а также как средства для адъювантной терапии при ревматоидном артрите [81]. Противодиарейная активность B. clausii была доказана в ходе клинических испытаний, которые показали, что использование этих микроорганизмов приводило к значительному уменьшению симптомов диареи и сокращению периода болевых ощущений [82].

Резистентность бактерий Bacillus к факторам внешней среды повышает их привлекательность как диетических добавок [83,84].

К настоящему времени для лечения и профилактики различных заболеваний у людей одобрены несколько штаммов Bacillus, обладающих пробиотическими свойствами. B. subtilis 3 и B. licheniformis31 (Биспорин) получили статус лекарственных средств в Украине и РФ и уже применяются в этих странах для профилактики и лечения острых кишечных заболеваний [80,85]. B. clausii (Enterogermina) and B. cereus (Bactisubtil) одобрены для медицинского применения в Европе. Недавно B. coagulans (GanedenBC30) получил в США статус полностью безвредного вещества – GRAS status. B. subtilis (natto) OUV23481 одобрен в Японии для применения в качестве пищевого продукта, предназначенные для оздоровления (статус FOSHU) [86].

Перспективы применения пробиотиков, содержащих бактерии Bacillus

Терапия с помощью пробиотиков привлекает повышенное внимание ученых в качестве стратегии, альтернативной традиционной антибиотикотерапии, прежде всего по причине появления новых патогенов, обладающих множественной резистентностью. Эффективность пробиотиков против патогенных бактерий была исчерпывающе зафиксирована в ходе многих научных исследований. Но многообразие патогенов и ограниченный спектр специфической активности существующих пробиотических бактерий делает очень актуальным вопрос улучшения пробиотиков. Последние достижения в области генной инженерии могут быть использованы для модифицирования культур пробиотиков как для усиления их уже имеющейся активности так и для создания новых штаммов с заданными свойствами. Таким образом имеется возможность воздействовать на механизм действия пробиотиков.

Бактерии Bacillus также обладают потенциалом для создания новых рекомбинантных пробиотиков. Их генетические особенности хорошо изучены, и такие бактерии можно использовать в качестве модели для клонирования различных про- и эукариотических генов. Рекомбинантные штаммы Bacillus используются для коммерческого производства биологически активных соединений (ферменты, антибиотики и тому подобное) [87]. Бактерии Bacillus не колонизируют слизистые оболочки на продолжительное время, это дает возможность контроля их численности и количества рекомбинантного белка с помощью различных доз и схем введения. Кроме этого, это уменьшает вероятность переноса генов и риск развития побочных эффектов, связанных с таким переносом.

Известно, что бактерии Bacillus обладают способностью выделять большие количества белков в среду культуры – это дает возможность создания таких штаммов, которые обеспечат внеклеточное производство рекомбинантных белков. Такой подход использовался для создания штамма B. subtilis с противовирусной активностью. Модификация пробиотического штамма Bacillus subtilis производилась с использованием плазмидной ДНК, содержащей химически синтезированный ген человеческого альфа-2 интерферона. Такой плазмид обладал устойчивостью внутри бактериальной клетки даже после образования спор и повторной герминации. Такая рекомбинантная бактерия вырабатывала интерферон экстрацеллюлярно в количестве 104-105 МЕ/мл [88].

Наличие противовирусной активности у рекомбинантного штамма B. subtilis в отношении вирусов гриппа, герпеса и энцефаломиелита лошадей была доказана in vitro и на животной модели [89]. Эффективность защиты животных против 10 LD50 доз вируса гриппа при пероральном введение рекомбинантного штамма составляла 70%, а против 100 10 LD50 доз – 50% [90].

Пероральное введения рекомбинантного штамма B. subtilis мышам значительно увеличивало цитотоксический эффект макрофагов и замедляло рост клеток карциномы легкого Льюиса [91]. Безопасность рекомбинантного штамма B. subtilis (Subalin) была доказана в ходе экспериментов in vitro и на животной модели [92], а также в ходе экспериментов с участием добровольцев [93]. Subalin проявил терапевтическую эффективность в ходе комбинированного лечения менингоэнцефалита [94] и вирусных гепатитов А и В [95]. Рекомбинантный штамм B. subtilis (Subalin) получил официальную регистрацию в Украине.

Была также успешно проведена модификация штамма B. brevis, для чего использовался плазмид, содержащий синтетический ген одноцепочечного прекурсора человеческого инсулина [96]. Авторам этого открытия удалось доказать, что полученный ими рекомбинантный продукт, полученный из супернатанта культуры, обладал биологической активностью, сходной с активностью человеческого инсулина. Проинсулин (ПИ) вырабатывался в больших количествах и выделялся в среду культуры рекомбинантным штаммом B. subtilis [97]. Максимальная концентрация ПИ в супернатанте достигала 1 мг/мл. Плазмидная ДНК использовалась и для модификации B. subtilis, которая обеспечила внутриклеточный синтез антагониста рецептора человеческого интерлейкина 1 (IL-Ra) [98]. После введения рекомбинантных бактерий лабораторным крысам и кроликам человеческий IL-Ra белок обнаруживался в неизменном виде и сохранившим биологическую активность в кишечном лаваже и сыворотке крови животных.

С помощью методов генной инженерии можно модифицировать споры Bacillus таким образом, чтобы они экспрессировали гетерологичные антигены. Наиболее изученной с этой точки зрения является система поверхностного дисплея спор [99]. Структурные белки оболочки CotB, CotC и CotG использовались для закрепления гетерологичных белков-«пассажиров» (временно взаимодействующие белки) на поверхности спор. Подход с использованием дисплея спор также применялся для создания на основе бактерий B. subtilis вакцины против столбняка [100, 101], вакцины против ротавируса [102], вакцины против сибирской язвы [103] и вакцины против трематоды Clonorchis sinensis [104]. Благодаря этому методу, были также успешно выявлены и другие белки: зеленый флуоресцентный белок GFPUV [105]; проинсулин [106]; сывороточный альбумин человека [107].

Выводы

Бактерии Bacillus как перспективные пробиотики вызывают возрастающий интерес исследователей.

Появляется все больше научных данных, свидетельствующих о большом значении этих бактерий в окружающей среде и для функционирования организма хозяина. Эти бактерии отличаются большим разнообразием в природе; они являются нормальной микрофлорой многих продуктов питания. Бактерии рода Bacillus постоянно проникают в пищеварительный тракт и дыхательную систему здоровых людей с пищей, водой и воздухом, они являются компонентом нормальной кишечной микрофлоры. Эти бактерии отличаются способностью к синтезу в больших объемах важных биотехнологических соединений – антибиотиков, ферментов, витаминов и аминокислот. Из многообразия видов Bacillus можно выделить штаммы, обладающие уникальными свойствами. Такие микроорганизмы обладают огромным потенциалом для создания новых рекомбинантных пробиотиков с заданными свойствами.

В настоящее время для создания рекомбинантных бактерий применяются различные методы, что позволяет получать микроорганизмы, синтезирующие гетерологичные белки, которые необходимы для лечения различных заболеваний или для производства вакцин.

Дальнейшее изучение механизма действия пробиотиков на основе Bacillus приведет к созданию новых пробиотиков на основе вновь открытых штаммов либо благодаря генной модификации для получения штаммов с заданными свойствами.