Антагонистические бактерии Bacillus subtilis: влияние на иммунитет и возможности клинического применения

Резюме. Статья посвящена теме влияния микрофлоры кишечника на развитие иммунной системы организма. Подробно описана роль Bacillus subtilis.

Ключевые слова: дети; Bacillus subtilis; иммунитет; профилактика

Иммунная система человека устанавливает баланс между реактивностью и толерантностью в отношении различных инфекционных агентов. Эндогенные и экзогенные сигналы приводят к активации провоспалительных процессов, одновременно запуская механизмы их локализации и угнетения [1].

Онтогенетическое формирование иммунной системы происходило в присутствии большого количества различных микроорганизмов: 1) комменсалов, переданных от генетически близких особей (родителей); 2) непатогенных представителей окружающей среды и 3) возбудителей инфекций, которые могут сосуществовать с макроорганизмом в виде носительства или разной степени выраженности клинических проявлений колонизации [2]. Это позволяет иммунной системе эволюционировать и развиваться на протяжении уже многих миллионов лет [3], воспринимая сигналы как из внешнего мира, так и от собственных клеток, внутри которых могут скрываться ДНК или РНК находившихся там ранее вирусов [4]. Комменсальная микрофлора участвует в развитии многих систем и органов человека — кишечника, костного и головного мозга [5], гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси [6] и непосредственно иммунной системы [3].

После рождения ребенка иммунная система генетически наследует механизмы врожденной защиты, но для полноценного взаимодействия с окружающей средой необходимы процессы распознавания и элиминации микробов, попавших в макроорганизм из внешнего мира. Это обеспечивается реакциями приобретенного (адаптивного) иммунитета, развивающегося в результате контакта с разнообразием микромира [7]. Следует заметить, что высокий защитный фон активации врожденного иммунитета также поддерживается микробными компонентами — пептидогликанами и липополисахаридами кишечной микрофлоры [8], в отношении которой функционируют механизмы иммунной толерантности, предохраняющие от чрезмерной стимуляции иммунитета и развития аутоиммунных процессов [9].

Таким образом, важным аспектом работы иммунной системы является сбалансированность иммунорегуляторных систем активации и супрессии. Физиологически этот баланс обеспечивается микроорганизмами, колонизирующими различные биологические ниши — кишечник, ротоглотку, дыхательные пути, кожу, мочеполовую систему [10].

Микрофлора активно участвует в формировании иммунобиологических реакций организма. Биологически активные вещества (модулины) бактериального происхождения стимулируют синтез иммуноглобулинов, интерферонов, цитокинов, увеличивают количество комплемента, повышают активность лизоцима, стимулируют созревание макрофагально-гистиоцитарной системы, а также оказывают целый ряд других эффектов [11].

Еще нет окончательного понимания механизмов такой иммунорегуляции, вероятно включающей системы дендритных клеток и Treg-лимфоцитов [12]. Но в любом случае в основе иммуноактивных взаимодействий лежит тесная связь между макро- и микромиром, одним из наиболее интересных представителей которого является палочковидная спорообразующая бактерия Bacillus subtilis (сенная палочка) — представитель рода Bacillus из семейства Bacillaceae [13]. Название «сенная палочка» вид получил из-за того, что накопительные культуры этого микроорганизма получали из сенного экстракта.

Bacillus subtilis является продуцентом некоторых полипептидных антибиотиков, а также ферментов (амилазы, протеазы), получаемых промышленно.

Благодаря высоким адаптивным возможностям Bacillus subtilis широко распространены в окружающей среде, и в частности в тех объектах, с которыми человек контактирует наиболее тесно (пищевые продукты, вода, воздух и т.д.). Поэтому бациллы постоянно и в значительных количествах поступают в организм человека и, поскольку являются устойчивыми к ряду пищеварительных ферментов, сохраняют жизнеспособность на всем протяжении желудочно-кишечного тракта.

Благодаря своим свойствам Bacillus subtilis уже более 100 лет привлекает внимание ученых. Так, например, в международной базе данных медицинских и биологических публикаций PubMed содержится более 32 тысяч публикаций, посвященных Bacillus subtilis, при этом с каждым годом их количество возрастает.

Ряд штаммов Bacillus subtilis способны образовывать устойчивые биопленки [14], кислотоустойчивые споры [15] и секретируют мощные противомикробные субстанции (бактериоцины, например субтилизин, кателицидин) для успешного выживания в кишечнике [13, 16], респираторном и урогенитальном тракте [17]. Bacillus subtilis является важным стимулятором для развития лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой кишечника, приводя к пролиферации Treg-лимфоцитов [18], модуляции синтеза цитокинов [19] даже в присутствии природных или синтетических антибиотиков [20].

Bacillus subtilis безопасна при употреблении человеком и в настоящее время используется в качестве пробиотика и основы для пищевых добавок [21]. В Украине пробиотики, содержащие различные штаммы Bacillus subtilis, производятся компанией ООО «ФЗ «Биофарма» в виде двух продуктов — Субалин и Биоспорин. Субалин содержит штамм Bacillus subtilis УКМ В-5020 и выпускается для детей младшего возраста в виде флаконов и саше (содержат 1 · 109 микробных клеток), для взрослых и детей старше 12 лет — в виде капсул (содержат 2 · 10⁹ микробных клеток). Эффекты пробиотика Субалин определяются способностью B.subtilis угнетать рост патогенной и условно-патогенной флоры, создавая, таким образом, благоприятные условия для роста представителей нормальной микрофлоры (бифидобактерий, лактобацилл, кишечной палочки). Именно благодаря этому Субалин способствует нормализации качественного и количественного состава микрофлоры кишечника.

Доказанные антагонистические эффекты Bacillus subtilis дополняются выраженным иммунотропным действием, которое доказано в большом количестве современных экспериментальных и клинических научных исследований, существенно расширяющих диапазон показаний для препаратов, содержащих данный микроорганизм в своем составе.

Влияние Bacillus subtilis на врожденный иммунитет

Эффекты Bacillus subtilis в отношении механизмов врожденного иммунитета характеризуются модулирующей направленностью, способной позитивно воздействовать как в условиях недостаточности иммунных стимулов, так и при патологических типах чрезмерной активации иммунной системы различного происхождения.

С одной стороны, Bacillus subtilis стимулируют дендритные клетки для синтеза IL-12, что способствует дифференцировке CD4⁺ Т-клеток по направлению к Th1-фенотипу, таким образом усиливая противовирусный и противоопухолевый иммунитет. Данный эффект дополняется одновременной активацией естественных киллеров CD16⁺ с обеспечением достаточной продукции альфа-интерферона и фактора некроза опухоли [22].

Споры Bacillus subtilis обладают высокой адъювантной активностью, индуцируя полноценный иммунный ответ на слизистых оболочках [23]. Вместе с вегетативными клетками Bacillus subtilis они способны стимулировать пролиферацию иммунных клеток в пределах лимфоидной ткани, индуцируя адекватный иммунный ответ и фагоцитоз [24].

С другой стороны, некоторые штаммы Bacillus subtilis обладают высокой антиоксидантной активностью, сдерживающей повреждение ДНК оксидативным стрессом в результате чрезмерной дегрануляции нейтрофилов при воспалительном процессе, что является эффективным инструментом компенсации его негативных последствий и может использоваться у пациентов с рекуррентными, рецидивирующими и хроническими заболеваниями инфекционного или аутоиммунного генеза [17].

Влияние Bacillus subtilis на клеточное звено адаптивного иммунитета

Важной является способность спор Bacillus subtilis вегетировать в просвете желудочно-кишечного тракта и его лимфоидной ткани (в пейеровых бляшках и брыжеечных лимфатических узлах), индуцируя Th1-иммунные реакции, характеризующиеся повышением продукции Т-клеток, синтезирующих ИФН-γ и усиливающих противовирусный иммунитет [25].

Еще одним аспектом иммунотропного эффекта Bacillus subtilis, который заслуживает особого внимания, является индукция ими синтеза цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+ и повышение активности этих клеток для противостояния внутриклеточным патогенам и злокачественной пролиферации [26], что создает прекрасные перспективы для профилактики вирусных и онкологических заболеваний.

Влияние Bacillus subtilis на гуморальное звено адаптивного иммунитета

Демонстрируя модулирующий характер своих иммунотропных характеристик, Bacillus subtilis, наряду с активацией клеточного звена адаптивного иммунитета, при пероральном применении вызывают Th2-поляризованные иммунные реакции, которые способствуют продукции В-клеток и антителогенезу [27]. В частности, это касается значительного увеличения концентрации фекальных и слюнных секреторных IgA при применении пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis, по сравнению с плацебо [28].

С учетом данной особенности Bacillus subtilis обладают значительным потенциалом для индукции антителоопосредованных иммунных механизмов защиты против инфекционных заболеваний [29].

Влияние Bacillus subtilis на регуляцию синтеза и активности цитокинов

Контакт Bacillus subtilis на индуктивных зонах слизистых оболочек с незрелыми дендритными клетками способствовал их более быстрому созреванию одновременно с повышением продукции IL-6 и ФНО-α CD4⁺ Т-лимфоцитами по сравнению с Т-клетками, которые были стимулированы антигеном без присутствия Bacillus subtilis [30]. Штаммы Bacillus subtilis стимулируют системную и кишечную продукцию гамма-интерферона, который играет важную роль в защите организма от различных инфекционных заболеваний, в том числе вирусных инфекций, и имеет множество иммунных функций, таких как стимуляция макрофагов и естественных клеток-киллеров [28].

Доказано, что Bacillus subtilis индуцирует секрецию IL-12, IL-2, IL-6, IL-10, гамма-интерферона и фактора некроза опухоли альфа, обеспечивая защиту против множества инфекционных возбудителей [31] и оказывая, таким образом, иммуномодулирующий эффект при различных заболеваниях, в основе патогенеза которых лежит воспалительный процесс.

Перспективы использования иммунотропных свойств Bacillus subtilis при создании новых вакцин

Вышеперечисленные иммунотропные свойства Bacillus subtilis в настоящее время активно используются для создания новых мукозальных и системных вакцин. В них Bacillus subtilis выступает в роли либо адъюванта (усилителя) [32], либо высокоиммуногенного носителя рекомбинантных антигенов [33], безопасного при использовании у людей [29].

При оральном введении вакцины, содержащей Bacillus subtilis вместе с антигенами H.pylori, в слизи желудка значительно увеличивается концентрация секреторного IgA, способствуя подавлению хеликобактерной инфекции. Также при сублингвальном и интраназальном введении вакцины, содержащей Bacillus subtilis и антигены столбнячного токсина, в кишечнике, респираторном и урогенитальном тракте была достигнута высокая иммунопротективная концентрация антигенспецифических IgG и IgA против токсинов столбняка. Подобный эффект был достигнут при введении комбинации Bacillus subtilis с антигенами ротавируса, что послужило основой для создания инновационной модели вакцины против данного возбудителя [27].

Рекомбинантные вакцины, созданные на основе вегетативных клеток и спор Bacillus subtilis, вызывают сбалансированный Th1/Th2 иммунный ответ, усиливая клеточные функции CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитов и синтез антигенспецифических IgA и IgG. Эти свойства делают Bacillus subtilis незаменимыми компонентами вакцин в качестве адъювантов [32].

Путем экспериментальных исследований были получены многообещающие результаты создания вакцин-кандидатов на основе Bacillus subtilis для формирования защиты против микобактерий туберкулеза, вируса папилломы человека, вируса ящура [34]. Особый интерес представляет усиление клеточного звена иммунитета при введении Bacillus subtilis, что обеспечивает значительный потенциал для разработки вакцин против многих вирусов (например, ВИЧ, грипп) и других внутриклеточных патогенных микроорганизмов [35].

Влияние Bacillus subtilis на инфекционную заболеваемость детей

Интегральным показателем иммунотропной активности Bacillus subtilis является способность данного микроорганизма при использовании в составе пробиотиков снижать количество инфекционных заболеваний, тяжесть их течения, частоту осложнений либо неудач стандартной терапии. В такой ситуации наиболее актуальным является изучение влияния на заболеваемость детей острой респираторной патологией вегетативных форм или спор Bacillus subtilis, а также возможность их безопасного и эффективного применения для терапии и профилактики данных инфекций.

Начало исследований в данном направлении было положено около 30 лет назад, когда было установлено, что оральное применение пробиотиков, содержащих споры Bacillus subtilis, приводит к снижению частоты респираторных инфекций у детей в возрасте 5–9 лет [36], снижает показатели заболеваемости у детей с частыми повторными острыми заболеваниями верхних дыхательных путей [37], облегчает течение рекуррентных отитов, приводя к более быстрому выздоровлению и снижению числа повторных эпизодов [38].

По данным В.И. Попович (2015), в процессе терапии острого бактериального риносинусита у детей интерферон, который вырабатывают Bacillus subtilis в организме, оказывает антиинфекционное (антибактериальное и противовирусное) действие, способствует повышению эффективности этиотропной терапии, обеспечивая эрадикацию патогенов. Благодаря свойствам Bacillus subtilis в составе пробиотика Субалин, последний способен повышать сопротивляемость организма вирусным инфекциям, что согласуется с рекомендациями Европейского руководства по лечению риносинуситов (редакция 2012 года) с высоким уровнем доказательности. Автор указывает, что такая методология является универсальной и приемлемой для оториноларингологов, педиатров, врачей общей практики — семейной медицины [39].

Применение Bacillus subtilis в составе пробиотика Субалин для комплексного лечения пациентов с паратонзиллитом и паратонзиллярным абсцессом предотвращает развитие антибиотикассоциированной диареи, способствует более быстрому регрессу воспалительного процесса и исчезновению болевого синдрома, а также улучшает качество жизни пациентов [40].

По данным собственных наблюдений, применение Bacillus subtilis в составе пробиотика Субалин у детей в возрасте 2–6 лет с частыми повторными ОРЗ приводило к снижению общего количества (на 47,7 %) респираторной патологии, ее тяжести, частоты развития бактериальных осложнений (на 63,3 %) и необходимости применения антибактериальных средств (на 50,0 %). При применении Субалина случаев нежелательных явлений и побочных реакций зарегистрировано не было, аллергические реакции на прием препарата не наблюдались.

Таким образом, многочисленными исследованиями доказаны иммунотропные свойства бактерии Bacillus subtilis. Важно, что они обладают не только стимулирующим, но и регулирующим потенциалом, способствуя нормализации функционирования механизмов врожденного и адаптивного иммунитета, что установлено современными клиническими исследованиями и может быть использовано для предупреждения развития инфекционных заболеваний. Более того, поликлональная иммунотропная активность Bacillus subtilis позволяет использовать ее у детей раннего возраста без опасности вызвать у них дисбаланс иммунной системы, которая еще находится в стадии формирования.

Возможность применения данной профилактической стратегии у детей обусловлена, кроме ее эффективности, высокой безопасностью и хорошей переносимостью пробиотиков, содержащих в составе Bacillus subtilis, что было неоднократно установлено на примере пробиотика Субалин (ООО «ФЗ «Биофарма», Украина).

Конфликт интересов. Не заявлен.

Актуальні посилання на першоджерела

1. Рекомендация Всемирной организации гастроэнтерологов http://www.worldgastroenterology.org/guidelines/global-guidelines/probiotics-and-prebiotics/probiotics-and-prebiotics-russian
2. http://www.empr.com/news/clostridium-difficile-probiotics-associated-diarrhea-hospital-stay/article/720064/ Can Probiotics Prevent C. difficile-Associated Diarrhea?
3. https://pharmacytimes.s3.amazonaws.com/v1_media/_pdf/PriorityOne-ProductTheatre-v4.pdf

Список литературы

1. Immune homeostasis, dysbiosis and therapeutic modulation of the gut microbiota / C.T. Peterson, V. Sharma, L. Elmén, S.N. Peterson // Clinical & Experimental Immunology. — 2015. — Vol. 179 (3). — P. 363-377.
2. Rook G.A.W. Microbial Old Friends, immunoregulation and stress resilience / G.A.W. Rook, C.A. Lowry, C.L. Raison // Evol. Med. Public. Health. — 2013. — Vol. 2013 (1). — P. 46-64.
3. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences / M. McFall-Ngai, M.G. Hadfield, T.C. Bosch [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2013. — Vol. 110. — P. 3229-3236.
4. Holmes E.C. The evolution of endogenous viral elements / E.C. Holmes // Cell. Host. Microbe. — 2011. — Vol. 10. — P. 368-377.
5. Normal gut microbiota modulates brain development and behaviour / R.D. Heijtz, S. Wang, F. Anuar [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2011. — Vol. 108. — P. 3047-3052.
6. Exposure to a social stressor alters the structure of the intestinal microbiota: implications for stressor-induced immunomodulation / M.T. Bailey, S.E. Dowd, J.D. Galley [et al.] // Brain. Behav. Immun. — 2011. — Vol. 25. — P. 397-407.
7. Virus-specific DMM. CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults / L.F. Su, B.A. Kidd, A. Han, J.J. Kotzin // Immunity — 2013. — Vol. 38. — P. 373-383.
8. Recognition of peptidoglycan from the microbiota by Nod1 enhances systemic innate immunity / T.B. Clarke, K.M. Davis, E.S. Lysenko [et al.] // Nat. Med. — 2010. — Vol. 16. — P. 228-231.
9. Fleming J.O. Helminth therapy and multiple sclerosis / J.O. Fleming // Int. J. Parasitol. — 2013. — Vol. 43. — P. 259-274.
10. Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents / C. Hoffmann, S. Dollive, S. Grunberg [et al.] // PLOS ONE. — 2013. — Vol. 8. — P. e66019.
11. Ершова И.Б. Особенности кишечного микробиоценоза при вирусных гепатитах и возможности его коррекции / И.Б. Ершова // Актуальна інфектологія. — 2014. — № 2 (3). — С. 6-10.
12. Induction of colonic regulatory T cells by indigenous clostridium species / K. Atarashi, T. Tanoue, T. Shima [et al.] // Science. — 2011. — Vol. 331. — P. 337-341.
13. Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract / H.A. Hong, E. To, S. Fakhry [et al.] // Res. Microbiol. — 2009. — Vol. 160. — P. 134-143.
14. Identification of Bacillus subtilis SipW as a Bifunctional Signal Peptidase That Controls Surface-Adhered Biofilm Formation / R. Terraa, N.R. Stanley-Walla, G. Caoa, B.A. Lazazzeraa // J. Bacteriol. — 2012. — Vol. 194 (11). — P. 2781-2790.
15. Cutting S.M. Bacillus probiotics / S.M. Cutting // Food. Microbiol. — 2011. — Vol. 28 (2). — P. 214-220.
16. Expressing antimicrobial peptide cathelicidin-BF in Bacillus subtilis using SUMO technology / C. Luan, H.W. Zhang, D.G. Song [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2014. — Vol. 98. — P. 3651-3658.
17. DNA-protection and antioxidant properties of fermentates from Bacillus amyloliquefaciens B-1895 and Bacillus subtilis KATMIRA1933 / E.V. Prazdnova, V.A. Chistyakov, M.N. Churilov [et al.] // Letters in Applied Microbiology. — 2015. — Vol. 61. — P. 549-554.
18. Role of commensal bacteria in development of gut-associated lymphoid tissues and preimmune antibody / K.J. Rhee, P. Sethupathi, A. Driks [et al.] // J. Immunol. — 2004. — Vol. 172. — P. 1118-1124.
19. The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter / M. Fujiya, M.W. Musch, Y. Nakagawa [et al.] // Cell. Host. Microbe. — 2007. — Vol. 1 (4). — P. 299-308.
20. Ratna Sudha M. Clinical Study of Bacillus coagulans Unique IS-2 (ATCC PTA-11748) in the Treatment of Patients with Bacterial Vaginosis / M. Ratna Sudha, K.A. Yelikar, S. Deshpande // Indian. J. Microbiol. — 2012. — Vol. 52 (3). — P. 396-399.
21. Minor P.D. Live attenuated vaccines: Historical successes and current challenges / P.D. Minor // Virology. — 2015. — P. 479-480.
22. Immunomodulatory effect of poly-c-glutamic acid derived from Bacillus subtilis on natural killer dendritic cells / S.W. Lee, H.J. Park, S.-H. Park [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2014. — Vol. 443. — P. 413-421.
23. Phagocytosis, germination and killing of Bacillus subtilis spores presenting heterologous antigens in human macrophages / M. Ceragioli, G. Cangiano, S. Esin [et al.] // Microbiology. — 2009. — Vol. 155. — P. 338-346.
24. Bacillus subtilis spores expressing the VP28 antigen: a potential oral treatment to protect Litopenaeus vannamei against white spot syndrome / A.T. Nguyen, C.K. Pham, H.T. Pham [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. — 2014. — Vol. 358 (2). — P. 202-208.
25. Esparza-Gonzalez S.C. Comparative analysis of Bacillus subtilis spores and monophosphoryl lipid A as adjuvants of protein-based Mycobacterium tuberculosis-based vaccines: partial requirement for interleukin-17a for induction of protective immunity / S.C. Esparza-Gonzalez, A.R. Troy, A.A. Izzo // Clin. Vaccine Immunol. — 2014. — Vol. 21 (4). — P. 501-508.
26. Foged C. License to kill: Formulation requirements for optimal priming of CD8(+) CTL responses with particulate vaccine delivery systems / C. Foged, J. Hansen, E.M. Agger // Eur. J. Pharm. Sci. — 2012. — Vol. 45 (4). — P. 482-491.
27. Immunogenicity of self-adjuvanticity oral vaccine candidate based on use of Bacillus subtilis spore displaying Schistosoma japonicum 26 KDa GST protein / L. Li, X. Hu, Z. Wu [et al.] // Parasitol. Res. — 2009. — Vol. 105 (6). — P. 1643-1651.
28. Probiotic strain Bacillus subtilis CU1 stimulates immune system of elderly during common infectious disease period: a randomized, double-blind placebo-controlled study / M. Lefevre, S.M. Racedo, G. Ripert [et al.] // Immunity & Ageing. — 2015. — Vol. 25. — P. 33-38.
29. Rosales-Mendoza S. Bacillus subtilis comes of age as a vaccine production host and delivery vehicle / S. Rosales-Mendoza, C. Angulo // Expert. Rev. — 2015. — P. 1-14.
30. Gram-positive bacteria on grass pollen exhibit adjuvant activity inducing inflammatory T cell responses / B. Heydenreich, I. Bellinghausen, B. König [et al.] // Clinical & Experimental Allergy. — 2012. — Vol. 42 (1). — P. 76-84.
31. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine / M. Song, H.A. Hong, J.M. Huang [et al.] // Vaccine. — 2012. — Vol. 30 (22). — P. 3266-3277.
32. Amuguni H. Bacillus subtilis: a temperature resistant and needle free delivery system of immunogens / H. Amuguni, S. Tzipori // Hum. Vaccin. Immunother. — 2012. — Vol. 8 (7). — P. 979-986.
33. Induction of neutralizing antibodies in mice immunized with an amino-terminal polypeptide of Streptococcus mutans P1 protein produced by a recombinant Bacillus subtilis strain / M.B. Tavares, B.M. Silva, R.C. Cavalcante [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. — 2010. — Vol. 59 (2). — P. 131-142.
34. Buccal and sublingual vaccine delivery / H. Kraan, H. Vrieling, C. Czerkinsky [et al.] // J. Control. Release. — 2014. — Vol. 190. — P. 580-592.
35. Developing plant-based vaccines against neglected tropical diseases: where are we? / S. Rosales-Mendoza, D.O. Govea-Alonso, E. Monreal-Escalante [et al.] // Vaccine. — 2012. — Vol. 31 (1). — P. 40-48.
36. Bacillus subtilis spores as a natural pro-host oral agent. Preliminary data in children / A. Novelli, A. Ulivelli, E.F. Reali [et al.] // Chemioterapia. — 1984. — Vol. 3 (3). — P. 152-155.
37. B. Subtilis spores as a natural pro-host agent in children suffering from recurrent respiratory tract infectious diseases / A. Novelli, A. Ulivelli, E.F. Reali [et al.] // International Journal of Immunopharmacology. — 1985. — Vol. 7 (3). — P. 355.
38. Evaluation of some immunologic parameters in children with recurrent otitis treated with spores of Bacillus subtilis / E. Galli, M. Corgiolu, L. Fiore [et al.] // Clin. Ter. — 1984. — Vol. 109 (4). — P. 329-334.
39. Попович В.И. Роль пробиотиков в оптимизации этиотропной терапии острого бактериального риносинусита / В.И. Попович // Здоровье ребенка. — 2015. — № 1 (60). — С. 49-53.
40. Попович В.І. Роль пробіотиків в оптимізації етіотропної терапії гострого паратонзиліту / В.І. Попович // Здоровье ребенка. — 2016. — № 7. — С. 49-53.